Методы определения концентрации антибиотиков в биологических жидкостях и тканях
При определении концентрации антибиотиков в организме наиболее широко применяют микробиологические методы исследования, основанные на способности антибиотика задерживать рост тест-микроба. Другие методы (физико-химические, радиоиммунологические, ферментные и др.) более точны, занимают меньше времени, но в ряде случаев для их проведения требуется специальное оборудование. Среди микробиологических методов определения концентраций антибиотиков в жидкостях и тканях организма наибольшее распространение получили метод диффузии в агар и метод серийных разведений в жидкой питательной среде.
Метод диффузии в агар
Метод основан на сравнении степени угнетения поста тест-микроба определенными концентрациями антибиотика в испытуемом материале с угнетением его роста известными концентрациями стандарта антибиотика. Подавление роста тест-микроба осуществляется за счет диффузии антибиотика из исследуемого материала в плотную питательную среду. Рабочими стандартами служат специально изготовленные очищенные образцы антибиотиков, активность которых устанавливают по международным стандартным препаратам. Они сохраняются в запаянных ампулах при температуре 4—10° С. На этикетках указано содержание единиц или микрограммов активного вещества в 1 мг препарата.
Антибактериальная активность антибиотиков выражается в единицах действия (ЕД), соответствующих действию определенной весовой части химически чистого препарата на тест-микроб. Для большинства антибиотиков (стрептомицин, антибиотики тетрациклинового ряда, канамицин и т. д.) 1 ЕД соответствует 1 мкг химически чистого препарата, а 1 мг такого препарата содержит 1000 ЕД. Для некоторых антибиотиков единицы действия были введены до получения химически чистых препаратов, в связи с чем их единица действия не соответствует 1 мкг химически чистого вещества (пенициллин, полимиксин, нистатин).
Методом диффузии в агар можно определить концентрацию всех антибиотиков, содержащихся в жидкостях (в крови, спинномозговой жидкости, моче, желчи, асцитической жидкости и т. д.) и тканях организма (в легких, печени, почках, мозге, мышцах и др.).
Для определения концентрации антибиотика в сыворотке кровь после образования сгустка центрифугируют, сыворотку отсасывают. Приготовленную сыворотку вносят в специальные лунки, изготовленные в агаровых пластинках, или в цилиндрики без разведения (если предполагаемая концентрация антибиотика в крови не превышает контрольную) либо разводят нормальной сывороткой человека или соответствующим каждому антибиотику буферным раствором.
«Рациональная антибиотикотерапия»,
С.М.Навашин, И.П.Фомина
Наибольшее значение разработка ускоренных методов определения концентраций в крови и тканях имеет для антибиотиков группы аминогликозидов. Вследствие незначительного разрыва между терапевтической и токсической концентрацией даже небольшое превышение пограничного уровня концентрации, который составляет для гентамицина и юбрамицина 6—8 мкг/мл, сизомицина — 4—6 мкг/мл, канамицина — 15— 20 мкг/мл, стрептомицина 25—30 мкг/мл, может сопровождаться побочными реакциями (ото-…
Для определения концентрации в испытуемом растворе можно использовать таблицы расчета активности антибиотиков (ВНИИА). Эти таблицы содержат числовые изображения кривых, имеющих различные углы наклона. Таблицы используют в сочетании со стандартной кривой. Угол наклона каждой кривой характеризуется разностью диаметров зон на стандартной кривой, создающихся при внесении в цилиндрики или лунки антибиотика в концентрациях, которые различаются в 2…
По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, выведенной из всех чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации, определенной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если поправка отрицательная. Пример. Средняя величина зоны контрольной концентрации…
В связи с тем что линейная зависимость между концентрацией и величиной зон задержки роста тест-микроба обнаруживается лишь в определенном интервале концентраций, растворы стандарта антибиотика должны быть точно подобраны. Для стандарта каждого антибиотика определяют концентрацию раствора, которая обеспечивает образование ж оптимальных зон задержки роста тест-культуры (контрольная концентрация). Такой концентрацией для бензилпенициллина является 1 ЕД/мл, олеандомицина —…
Для приготовления растворов стандарта антибиотика делают произвольную, но точную навеску на аналитических весах v Навеску растворяют в соответствующем растворителе (смотрите таблицу ниже) из расчета 1 мг в 1 мл или 1000 ЕД в 1 мл (основной раствор). Дальнейшие разведения готовят путем разведения основных растворов до нужных концентраций. Для улучшения условий диффузии антибиотиков в агар для…
Посевная доза тест-микроба должна быть предварительно установлена для каждой серии среды в пределах цифр, указанных в таблице ниже. Увеличение плотности посева может сопровождаться образованием густого микробного «газона» и уменьшением размеров зон задержки роста тест-микроба. При засеве недостаточным количеством микробных клеток на поверхности среды не образуется сплошного роста, зоны не имеют очерченного края и не могут…
Для определения концентрации антибиотиков в тканях органы после удаления остатков крови взвешивают и гомогенизируют путем растирания с кварцевым песком или в специальном смесителе. К гомогенату добавляют дистиллированную воду или соответствующий буфер. Полученную взвесь центрифугируют 30 мин при 2500—3000 об/мин. Концентрацию антибиотика определяют в надосадочной жидкости. Для получения воспроизводимых результатов необходима строгая стандартизация опытов. Скорость диффузии…